根癌农来杆菌（emphasis：自role=italicAgrobacterium：tumefaciensemphasis）是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤（crown：gall：tumor）。

根癌农杆菌细胞中含有Ti质粒，通过侵染植物伤口进入细胞后，将T-DNA插入到植物基因组中，因此，根癌农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助根癌农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

根癌农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，AT-MT）。根癌农杆菌（Agrobacterium tumefiwww.rixia.ccciens）能够在受伤部位侵染植物，将其Ti质粒上的T-DNA（transfer DNA）转入植物细胞并整合进植物的基因组。根据农杆菌的这一特点根癌农杆菌介导植物细胞的转化已发展成为一种常用的遗传转化方法。除了转化植物细胞以外，ATMT对酵母、丝状真菌、动物细胞均实现了成功的转化。对丝状真菌转化来讲，传统的丝状真菌转化方法需制备原生质体，而ATMT对丝状真菌的转化可以孢子、菌丝等直接作为转化受体，操作更为简便。因此，ATMT在丝状真菌的转化中的应用日益广泛，并也被应用在对木霉菌的遗传转化中，已经成为最常用的转化真菌木霉的转化方法之一。

8.1.5.1 根癌农杆菌介导转化原理

根癌农日夏养花网杆菌介导木霉等真菌的转化原理同对植物的转化原理基本是一致的。已有研究表明，根癌农杆菌介导木霉等丝状真菌的遗传转化同样需要vir基因的表达。目前，对根癌农杆菌介导转化中参与外源基因转移的相关基因的转录和调控机理已研究得相当深入。其中，农杆菌Ti质粒上毒性基因vir的表达是完成遗传转化所必需的。在一些酚类化合物的作用下，例如乙酰丁香酮，诱导Ti质粒上vir基因的表达，合成T-DNA转移所需的一些蛋白质。它们编码的蛋白质产物参与单链T-DNA的合成、加工和转移等过程。

其中，VirA与VirG为调节蛋白，呈低水平的组成型表达，当外界存在酚类化合物例如乙酰丁香酮等诱导物时，可以激活由vir产生的VirA和VirG组成的双重调控系统。在特定单糖存在的情况下，染色体基因表达的蛋白质ChvE与VirA相互作用进一步增强了vir基因的表达水平。VirA是一种膜镶嵌蛋白，在乙酰丁香酮的作用下，能够自动磷酸化，活化后的VirG是一种DNA结合蛋白，作为转录激活因子，能进一步激活本身基因和vir区其他基因的表达。

T-DNA以单链的形式转入受体细胞，因此，首先是单链T-DNA的合成及加工，VirD编码的产物VirD1和VirD2参与其中。在VirD1协助下VirD2可与T-DNA两侧的边界重复序列的特定位点结合并切割产生缺口，止于左侧边界重复序列。在靠近右边界重复序列有一个25bp的强驱动序列，VirC1蛋白结合在这个地方，也刺激了T-DNA 单链的产生。随后，在DNA聚合酶的作用下，于缺口处进行单链T-DNA的复制，当复制进行到另一缺口时，T-DNA释放并与VirD2结合为VirD2/T-DNA复合体。

单链形成以后，T-DNA就会通过Ⅳ型的分泌机制，穿过细菌的细胞膜和细胞壁，VirB和VirD4蛋白参与了这个过程。VirB编码产物在细菌的表面形成转运孔道和T-pilus的结构。virD编码产物VirD4为膜嵌蛋白，介导VirD2/T-DNA复合体和VirB蛋白复合体的相互作用。VirD2/T-DNA组成的复合体及VirE2和VirE3通过IV型分泌机制转出细菌。

目前，对单链T-DNA复合物进入受体细胞的机制尚不清楚，但对由受体细胞质向细胞核的转移机制已有了一些初步的认识，VirD2和VirE3在其中发挥关键作用，这两种蛋白引导T-DNA进入受体细胞核，其中，VirD2含有核定位信号序列NLS，可以与宿主细胞的A核周蛋白（karypherin）发生作用而被转移到细胞核。同时，VirE3还可以与受体细胞中的A核周蛋白结合而通过依赖于A核周蛋白的途径被转运到受体细胞核中，从而引导T-DNA复合物进入细胞核。一旦进入细胞核内，T-DNA能稳定地整合到基因组中。T-DNA整合的具体机制现在还不很清楚，但宿主的蛋白质应起了重要的作用（Caroline et al.，2005）。

8.1.5.2 根癌农杆菌介导转化的步骤

（1）双元载体的构建。双元表达载体系统实际上就是一个质粒，双元载体包含两个部分，一个部分是能够被转移的T-DNA，另一个是能够帮助T-DNA转移的Vir区。转移区是有左右边界的，一般将含有合适真菌启动子和终止子的抗性基因插入T-DNA的两个边界序列之间，例如潮霉素B基因（hygromycin B phosphotransferase gene），在转基因时会在左右边界处断裂，只将左右边界以内的T-DNA区域整合到宿主基因组中。双元表达载体可以通过冻融法、三亲交配或电激法转化（大肠杆菌供体菌+大肠杆菌协助菌+根癌农杆菌受体菌），将构建好的质粒载体转入根癌农杆菌。根据目的的不同，构建的双元载体可分为两种类型：随机插入型和靶基因插入型的质粒载体。靶基因插入型的质粒载体要在抗性基因两端连接一段与目的基因序列同源并且长度合适的DNA片段，通过同源重组造成靶基因的突变。为了基因克隆，还可以在边界重复序列之间插入适当的克隆载体，使用质粒拯救和TAIL-PCR等方法从转化子中重新获得T-DNA和目标基因片段。

（2）根癌农杆菌的活化和培养。从YEP平板上挑取含有双元载体的根癌农杆菌单克隆菌落接种于含有合适抗生素的7mL YEP液体培养基中，250r/min，28℃过夜培养。次日，用诱导培养基IM（含200M乙酰丁香酮）稀释到OD660为0.15，然后继续培养4～6h至OD660为0.6～0.8。

（3）共培养和转化子的筛选、鉴定。将100L诱导活化的根癌农杆菌和等体积的木霉分生孢子悬液混合后均匀地涂布在含有200M乙酰丁香酮的IM培养基平板上，28℃条件下培养48h，然后在IM培养基平板上覆盖一层含100g/mL潮霉素（或其他抗生素）的PDA培养基（含有50g/mL的四环素以杀死根癌农杆菌）。继续培养4～7d，将长出的转化子挑到含潮霉素培养基上进行筛选培养。将抗性菌转接到含药培养基上继续培养，提取基因组DNA，通过PCR扩增和Southern杂交来鉴定疑似转化子及插入T-DNA的拷贝数。

8.1.5.3 影响根癌农杆菌介导遗传转化效率的因素

ATMT相对于其他转化方法，虽然具有转化效率高的特点，但其转化效率也同样受诸多因素的影响。这些因素包括根癌农杆菌菌株类型、转化受体类型、根癌农杆菌与受体的浓度、乙酰丁香酮的浓度和共培养环境条件（时间、温度、pH值）等。

ATMT受体材料来源广泛，不仅可以是原生质体，还可以是孢子、菌丝体及子实体组织等，从而扩大了农杆菌介导真菌转化的范围。但是个别真菌只能转化特定的类型。例如，ATMT对粗球孢子菌（Coccidioides immitis）只有以萌发的孢子作为初始材料才能转化成功，但对根霉菌（Rhizopus oryzae）和毛霉菌（Mucor circinelloides）只有以原生质体为初始材料才可。而对木霉来说，主要用分生孢子和菌丝作为转化的对象。但不同菌株的转化效率差别也是很大的。

常用于转化真菌的农杆菌菌株有AGL-1，EHA105，LBA1100，LBA4404及C58C1等，不同农杆菌菌株对转化效率的影响很大。对同一受体材料来说，不同农杆菌菌株对转化效率影响很大，例如，Kemppainen等（2005）发现对外生菌根生共体LaccarrjrORgPHOia bicolor来说，根癌农杆菌LBA1100和AGL-1转化效率相差4倍，AGL-1更适用。高兴喜等（2004）用AGL-1和LBA4404对 T.harzianum T88进行遗传转化发现，其中 LBA4404并不能转化T.harzianum T88，而AGL-1转化T.harzianum T88获得成功。综合相关报道可得出具有高Vir毒力的菌株，相对有较高的转化效率，而且不同菌株和载体类型对转化效率的影响还具有互作效应。

乙酰丁香酮（AS）是诱导农杆菌毒性基因表达的基本因素，也是转化成功与否的一个关键因素。AS在根癌农杆菌共培养期间是必需的。共培养前，利用AS对根癌农杆菌进行诱导培养，可以提高转化效率。其中，共培养基中AS的加入与否直接决定转化的成功与否，加入的浓度决定转化效率的高低；诱导过程中不加入AS会导致rjrORgPHO转化效率的降低。此外，共培养基中AS浓度会影响T-DNA插入的拷贝数，通常浓度过高会增加T-DNA插入拷贝数。如Mullins等（2001）在转化尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的过程中发现随着AS浓度的增加，T-DNA插入拷贝数也增加。

转化受体的细胞浓度和农杆菌的浓度也会影响转化效率。随着受体菌或农杆菌浓度的增加，转化效率会明显提高。但两者作用增长有一定限度，农杆菌过量会造成转化效率降低。而且高浓度的农杆菌共培养之后很难抑制其生长，从而影响转化子的生长。而受体菌浓度过高，会对转化子的挑取造成困难。

此外，共培养的环境条件（培养温度、时间和pH值）对转化效率也有一定的影响，共培养时间太短不能形成转化子，随着共培养时间的延长，转化子数目相应增加，对于木霉来说，由于生长过快，培养时间过长容易造成菌落重叠，不宜于菌落的筛选，一般共培养时间控制在24～48h之内。温度对转化率的影响没有共培养时间显著，温度范围一般为20～37℃，22～25℃为最佳温度。在比较高的温度下（＞28℃），根癌农杆菌不能很好地发挥其功能。共培养基的pH值对转化效率也有明显的影响，一般在pH值为6.0左右时效率较高，增加或降pH值都会使转化效率明显降低，尤其在高pH值条件下，转化效率更低，这可能是由于高pH值对毒性蛋白的表达有不良影响。例如，黄亚丽（2008）考察了共培养的环境条件对T.harzianum转化的影响，发现在一定范围内随着共培养时间的延长、温度的升高其转化效率明显增加。但是，时间过长、温度太高转化效率反而降低。以转化温度24℃为例，在共转化24h时转化效率为14个转化子/107个孢子，36h为200个转化子/107个孢子，48h转化效率最高为275个转化子/107个孢子，而当共转化时间延长到72h时，在共培养平板上木霉菌丝生长的过多，当转到抗性日夏养花网平板后在培养基上出现了大量的背景菌落，可能是因为潮霉素B不能杀死已经过多、过旺生长的木霉菌丝的缘故。共转化温度对转化效率的影响也存在拐点，在温度低时转化效率较低，随着温度的升高转化效率逐步提高，等达到一定温度后，再提高温度，转化效率反而会降低。这可能是因为温度过高或过低都不利于农杆菌毒性蛋白功能的发挥。对于pH值来说，共转化在pH值为5.3的环境中最适，增加或降低pH值都会使转化效率明显降低，当pH值高于6.5之后几乎没有任何转化子产生。