virus-free tissue culture technique

魏宁生

用组织培养技术，从带毒植物的茎尖、芽等组织获得无毒再生植株的方法。在脱毒过程中主要选用茎尖、芽等生长点作为外植体（explant），故又称为茎尖脱毒（virus-free meristem culture）。组培脱毒是在组培培养学和病毒学相结合的基础上发展的技术。

简史

1922年美国罗宾斯（J.A.Robins）等用豌豆、玉米和棉花根尖进行组织培养首次获得完整植株。1943年美国怀特（P.R.White）发现在感染烟草花叶病毒植株生长点附近病毒的浓度很低，甚至没有病毒。1952年摩瑞尔（G.M.Morel）等用感病的大丽菊茎尖分生组织，第一次培养得到脱毒的大丽菊，标志着组培脱毒研究工作的开始。以后相继进行了马铃薯、菊花、兰花、百合、草莓、矮牵牛、鸢尾等茎尖脱毒的研究，并获得成功。中国最早的组培工作是李继侗等1933年用银杏胚培养成植株。其后，罗宗洛、崔澂、罗士韦等在玉米、烟草等作物上进行了幼胚、根尖和茎尖组织的培养。吉林农业大学等单位率先开展了茎尖脱毒工作，1976年中科院等单位用茎尖脱毒技术获得了无毒马铃薯。目前已得到了菊花、大蒜、百合、石竹等植物的无毒植株（种球）。利用茎尖脱毒技术获得无毒种球（苗），已成为防治病毒病的一项有效途径。

组培脱毒法和程序

即茎尖脱毒法。主要是茎尖的选取和消毒、培养基制备等。

茎尖的选取和消毒

一般选用茎尖和芽，若为休眠鳞茎、球茎需先进行低温处理待发芽后再取材。材料用75%酒精表面消毒，再用0.1%升汞溶液消毒，经无菌水冲洗2～3次置于解剖镜下切取茎尖0.1～1.0毫米的切段，移植到愈伤组织培养基上培养，所有操作均在无菌条件下进行。

培养基的制日夏养花网备

用于组织培养的培养基有30种以上，但都是在费佛培养基的基本配方上加以改进，并加入一些活性物质发展而来的。目前应用的大多数培养基是为培养愈伤组织设计的，所以对茎尖培养并不完全适合。摩瑞尔农事培养基等适用于生长点培养，其主要成分为硝酸钙（Ca（NO3）2）、硝酸钾（KNO3）、硫酸镁（MgSO4）、硫酸亚铁（FeSO4）、肌醇、生物素等，可用于大丽菊、菊花、百合等茎尖脱毒培养。大量的研究结果表明：培养基附加2，4-D、激动素（KT）可有效地使许多外植体产生愈伤组www.rixia.cc织；当提供1毫克/升激动素（KT）和0.3毫克/升吲哚乙酸（IAA）时，能用于草本植物的茎尖培养，建立脱毒植株繁殖系。一般激动素/生长素的比例大，有利于芽的发生；生长素/激动素比例大，则有利于根的发生。

组培的条件

要求光照强度在1500～2000勒克斯，每日光照10～12小时，温度为22～2www.rixia.cc5℃。

脱毒效果的鉴定

主要有鉴定植物法和抗血清鉴定法。

植物鉴定法

利用病毒在指示植物上产生的特有症状来鉴定病毒，一般采用枯斑反应寄主。

抗血清鉴定法

常用的是琼脂双扩散法和免疫电镜法。琼脂双扩散法测定过程是先将热溶的精制琼脂溶液倒入培HCGdcQKc养皿中，待冷却形成一层凝胶后在胶上打孔，孔的直径为0.3～0.4厘米，两孔间距约0.5厘米，然后将样品（抗原）和抗血清（抗体）加入不同位置的孔中进行扩散，观察有无沉淀带。免疫电镜法根据抗体和抗原在铜网上的结合方式又分为两类：聚焦法是在铜网上先加抗血清，固定1小时后再加待测样品，用磷酸缓冲液冲洗并负染待干燥后观察。修饰法是先加病毒样品，再加抗体，负染观察。另一种血清检验方法是斑点免疫结合测定法，此法是对酶联免疫吸附法（ELISA）的改进，使之更为方便、实用。具体方法是用华特曼1号滤纸打成直径为7毫米的圆片来代替微量固定反应板，将测样分次滴在小片上并使之干燥后，放入直径为10～15毫米的圆筒状小瓶中加入抗血清，在旋转振荡器上摇动0.5～1小时。然后用TBS洗涤。再加入A蛋白—过氧化物酶于小瓶中，连同纸片一块摇动15～30分钟，再洗涤。最后加入底物——氯http://www.rixia.cc萘酚并摇动10分钟即可。如果是正反应，在滤纸片中央呈现深蓝色，负反应仅呈现均匀的淡蓝色。

经鉴定获得无毒植株后需要复壮培养和快速繁殖再进入推广应用。在生产环节中应尽量避免病毒的再度感染，有个别植株感病时应及时拔除。