植原体、螺原体等无壁菌门的原核生物造成的植物病害与植物病毒产生的症状相似，无病症表现，因此，它们又日夏养花网叫病毒类似病害。花卉上比较常见的是植原体病害，因此我们介绍一下植原体病害的诊断和鉴定。

1 超薄切片，电镜下观察植原体

方法如植物病毒的超薄切片和电镜观察。

2 抗生素治疗诊断

用四环素、土霉素和金霉素等对受病植株进行叶面喷施和灌根，植原体对这几种抗生素敏感，病害症状可以得到缓解。而植物病毒对抗生素不敏感，如果施用，对病害无效。

3 植原体PCR检测

根据植原体的共同保守序列，用植原体16S rRNA基因通用引物R16mRl/R16mF2进行植原体直接PCR扩增，可扩增到植原体的特异扩增带。

还可以将直接PCR产物分别稀释40倍后，引物换为R16R2/R16F2进行巢式PCR扩增，可得到与引物设计相符的植原体的特异扩增带，说明为植原体病害。

这里以仙人掌植原体丛枝病的PCR检测为例，介绍植原体的PCR检测技术。

实验操作如下：

Ⅰ.总核酸提取

（1）取0.3g植株幼嫩组织，用液氮冷冻后充分研磨成粉状。

（2）移入含有0.6ml预热到60℃的CTAB DNA提取缓冲液中，在60℃水浴中温浴30min。

（3）加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），抽提30min。

（4）12000r/min离心8min，取上清液，重复（3）、（4）步直至蛋白质除尽。

（5）加入氯仿∶异戊醇（24∶1），抽提30min，12000r/min离心8min，取上清液。

（6）加入等体积预冷的异丙醇及1/10体积的醋酸钠（3mol/L，pH5.2），混匀，-20℃保持至少30min，14000r/min离心10min，使核酸沉淀。

（7）用70%乙醇洗涤2次后，.真空干燥。

（8）沉淀溶解于100l TE缓冲液中。

（9）取10l DNA经0.7%琼脂糖凝胶电泳后观察结果，计算DNA浓度。其余于-20℃冰箱中保存备用。

Ⅱ.PCR扩增

参照Lee所报道的植原体16S rRNA基因通用引物对R16mF2/R16mRl序列和R16F2/R16R2序列合成引物，引物序列如下：

R16mF2：5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′

R16mRl：5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′

R16F2：5′-ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3′

R16R2：5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′

引物溶解于适量灭菌水中至终浓度为10mol/L。

直接PCR（Direct-PCR）：

（1）取一PCR薄壁管，依次加入下列试剂

10PCR反应缓冲液 5l

5mmol/L MgCl2 4l

2.5mmol/L dNTP 4l

R16mF2（或R16F2） 3l

R16mRl（或R16R2） 3l

4U/l 1TaqDNA聚合酶 1l

模板 2l

加入双蒸水至终体积为50l，混匀并加入30l石蜡油。

（2）PCR扩增。反应循环为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火1min，72℃www.rixia.cc延伸90s，35个循环后于72℃保温10min，4℃冰箱中保存。

（3）取5l PCR产物于1%琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。

巢式PCR（Nested-PCR）：

将用引物对R16mF2/R16mRl扩增的直接PCR产物按1∶40比例稀释后，作为反应模板，引物对换为R16F2/R16R2，退火温度升高至60℃，其余反应条件同直接PCR。

Ⅲ.结果

用植原体16S rRNA基因通用引物R16mRl/R16mF2进行植原体直接PCR扩增，可扩增到一条约1.5kb的特异扩增带（图1）。通过实验，用泡桐丛枝作为植原体的阳性对照，检测出YNOl样品（仙人掌品种珊瑚枝丛枝）和YNO2（仙人掌品种堆罗汉丛枝）为植原体病害。其他YNO3（仙人掌品种猪耳掌丛枝）、YNO4（仙人掌品种金狮子丛枝病）、YNO5（仙人掌品种青海波丛枝）不是植原体病害，可能为品种的特性。

图1 直接PCR扩增结果

将直接PCR产ocaNxwlr物分别稀释40倍后，引物换为R16R2/R16F2进行巢式PCR扩增，可得到一条约1.2kb的特异条带，与引物设计相符（图2），说明为植原体病害。直接PCR的检测灵敏度为10pg DNA，而巢式PCR可以提高检测灵敏度。使用直接PCR的检测得到比较模糊条带的，使用巢式PCR可以得到非常明显的条带。

图2 巢式PCR扩增结果

目前检测主要采用生物学、凝胶电泳和分子生物学方法。

鉴别寄主：

木本指示植物：生物学方法将待检毒源嫁接到寄主上，根据其症状表现来确定类病毒的一种方法。现在仍作为一种基本的诊断方法应用于植物类病毒的检测中。但这种方法周期长，费时、费力，且易受外界环境条件的影响。所以，不适于类病毒的快速检测。常用的指示植物为桃树苗（GF305品种）鉴定方法有以下三种：

（1）温室鉴定。

症状出现时间和严重度，因病毒株系不同而异。潜隐株系一般不产生症状，但在某些情况下，也有1%的接种株表现出花叶症状，病斑主要分布在叶脉附近。强毒株系则产生较大的黄色病斑。叶片生长停止，出现小而窄的薄叶。接种30～60d后，接种株上出现较强的症状反应，叶片卷曲和变红，茎干上出现溃疡斑死亡。有时症状较轻，仅叶片卷曲，茎干上产生茎痘斑。

（2）交叉保护技术鉴定。

主要用来检测潜隐株系。日夏养花网即用GF305作指示植物，先在上面嫁接一个待检芽。两个月之后，再接种强毒株系芽。如果指示植物不表现症状，就说明待检芽带有潜隐株系。

（3）田间鉴定。

潜隐株系侵染，叶片伸展期推迟4～6d，指示植物仅在接种后第二年开花。它们也引起叶片扭曲，沿主脉产生褪绿斑驳。果实少而小，果核变大，成熟期推迟4～6d。强毒株系侵染，5～6月叶片产生褪绿花叶（污斑）或黄叶花叶症状。1/3的接种树，茎干上产生茎痘斑。

血清学检测：凝胶电泳即双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（PAGE）（Floresetal.，1991;Floresetal.，1992），是根据类病毒的特殊分子结构来检测类病毒的技术。这种技术快速、简单且投入少，在类病毒检测的早期阶段，被广泛地应用并不断完善。但其精确度较低，而且PAGE电泳只能诊断出是待检材料中是否有类病毒的存在，不能对类病毒的种类作进一步的鉴定。电泳法检测的灵敏度不如交叉保护法。

分子生物学检测：主要包括核酸分子杂交、RT-PCR技术及最近报道的RT-PCR-探针捕捉杂交（也称RT-PCR-酶联免疫反应）等。核酸分子杂交技术是较为常用的类病毒的检测方法，特别是光生物素、地高辛等非放射性标记技术的发展，大大提高了实验的安全性。核酸分子杂交技术特异性强，克服了PAGE电泳的不足，但其检测的准确性依赖于模板的质量，而类病毒在寄主中含量又较低，致使检测结果常存在假阴性的问题。RT-PCR技术的引入（HadidiandYang，1990；Hadidietal.，1991；Kanematsuetal，1991；Yangetal，1992；Levyetal.，1994），提高了类病毒检测的灵敏度。Nakanhara等（1999年）曾同时用RT-PCR和核酸分子杂交两种方法检测类病毒，发现前者的灵敏度是后者的10～100倍。但RT-PCR技术存在假阳性的问题，而且引物的设计和反应条件也影响检测的准确性。RT-PCR-探针捕捉杂交技术是RT-PCR和核酸分子杂交技术的结合，综合了二者的优点，使检测RT-PCR的扩增产物的灵敏度比传统的凝胶电泳提高了至少100倍。在杂交中以cRNA探针代替cDNA探针，又可以提高检测的灵敏度。

检疫危险性评价：本病的病原桃潜隐花叶类病毒可通过桃、杏、巴旦杏、李的繁殖材料进行远距离传播，并可经桃蚜和螨类扩大蔓延，对桃的生产可构成严重经济损失。季良进行危险性评价时，危险度值10分，为高危有害生物。国内虽已有发生，鉴于其危害的严重性，和EPPO将该病害列入A1名单，我国也应列入进境植物检疫危险性有害生物名单，同时作为国内防治重点。

地理分布：北美洲发现的桃树潜隐花叶病在欧洲没有分布，只有法国从美国进口的植物材料上发现桃树花叶病，可以断定这种病害源于美洲（Desvignes等1988）。其他有中国、日本、阿尔及利亚、法国、希腊、意大利、摩洛哥、西班牙、墨西哥、美国（南加利福尼亚、南犹他、亚利桑那、新墨西哥、南俄克拉何马、西阿肯色、西科罗拉多、得克萨斯）。法国从美国和日本进口的桃树中，分别有20%和60%的桃树发生这种病害。在欧亚地区的苹果、杏、李、樱桃上也时常检测到PLMVd的存在。据报道，在我国有的果园桃树PLMVd发生较普遍，通过采用生物学和斑点印迹杂交对部分显症样品进行检测，其PLMVd的潜带率达64.3%（张少瑜等，2000）。

检疫国家地区：巴拉圭、波兰、俄罗斯、罗马尼亚、秘鲁、斯洛文尼亚、土耳其、英国、法国、意大利、澳大利亚、印度尼西亚、阿尔及利亚、冰岛、摩洛哥、斯洛伐克等。EPPO将该病害列入A1名单（OEPP/EPPO1978）。这种病害的病原是桃潜花叶类病毒，并已在EPPO一些国家发生或传播，所以应将这种病害从A1名单修订到A2名单中。但是，在欧洲、北美洲和亚洲导致桃花叶病的所有病原特性完全了解之前，这些非欧洲起源的类病毒在EPPO仍具检疫意义。

应检植物：桃、杏、巴旦杏、李的无性繁殖材料。

检疫措施：EPPO要求（OEPP/EPPO），所有桃树苗必须经过生长期观察为健康的；疫区繁殖材料必须来自经过检测为健康的母本植株（OEPP/EPPO，1991；1991/1992）。