生物学中最漂亮的实验——美丽的意外

 (2017-12-12 23:22:49)

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dna复制模式

 

生物学中最漂亮的实验

   分类： 必修二    

今天在改作业时，发现学生在作业的最后给我留了一个疑问“15N标记的DNA半保留复制实验中是否需要进行大肠杆菌的同步？”这是一个很棒的问题，而且也是第一次选考给学生造成的心理阴影的一种体现。对于这个问题一下子我也没有反应过来，或者说以前从来没有考虑过这个问题。

对于这个问题，其实回答起来比较难。在理想状态下大肠杆菌每20分钟分裂一次，但是资料显示大肠杆菌的拟核DNA需要30分钟才能完成复制。怎么解决这个问题呢？科学家发现大肠杆菌在一次复制还没有结束的时候下一次复制已经开始了，中间有一个重叠，大约十分钟左右，弥补了时间上的不足。从这一事实来看，很难提取到完整的双链DNA，除非同步化，让完成复制的DNA不再复制，使调查的大肠杆菌停留在某一状态不再进行下去，也就是同步化。但是Meselson-Stahl当时有这项技术吗？于是在信息查阅的过程中发现了事实，也发现了这样一篇文章《辩护生物学发现中的“巧合“——Meselson-Stahl实验的个案分析》

Meselson-Stahl实验被称为“生物学中最漂亮的实验”，由于这个著名的实验以及其他重要的研究，Meselson获得了2004的Lasker医学奖，此前，他曾在1995年获得摩尔根奖章。

1953年4月25日，Watson和Crick发表DNA结构的著名论文，接着（5月30日）他们发表了关于DNA遗传功能的论文，提出了后来被称为半保留的DNA复制模式。1953年后出现在几种可能的DNA复制模式：全保留模式、分散保留模式、头对头保留模式等。分散保留的结果是，同一链上新合成的DNA和老DNA相间排列；头对头保留模式的结果是，同一DNA链一端是新合成的，另一端是老的部分，属分散保留的极端形式。

1953年，Meselson和Stahl获得了方法上的突破，采用温度的同位素15N作DNA标记，导致DNA分子密度显著增加，从而可以通过密度梯度离心将亲代链和子代链区分开来。他们将大肠杆菌放在含有15N的培养基上生长，使亲代DNA分子双链都标记上15N（重链），提取DNA进行CsCl梯度离心只有一条带位于离心管底部，紫外吸收光谱只出现一个大峰。然后再将持续生长的后代放在含14N的培养基中生长，使新合成的链中所含的氮元素皆为14N（轻链）。具体分析不再这里赘述。

若是半保留复制应只出现一种“杂种链”，有15N标记的亲本链和14N标记的子链互补而成；而若是全保留复制应有两种双链，亲代双链皆由15N标记，新合成的链有14N标记；若是按分散型也只会产生14N和15N相同排列的一种双链。实验结果显示离心管中只出现一条带，位于中部，紫外吸收峰也出现一条中等峰。表明半保留复制模型是和实验结果完全吻合，全保留模型可以排除但分散模型却不能排除；将持续生长的E.coli再放入含14N的培养基中培养，按半保留复制模型应有两种双螺旋，一种由含14N /15N组成的轻链，另一种是由轻链和重链组成的杂种链。这两种链的数量相等；若按全保留复制，预期也会产生两种链，但和前者不同，一种是完全由轻链组成的双链，另一种是完全由重链组成的双链，轻重之比为3：1；若按分散模型，第二代子链都是轻重相间排列，仅轻链片段比日夏养花网例要多于重链片段，所以预期仅一条带位于中上部。实验的结果是离心管中持续两条带，比例相等，一条位于上部（轻链），一条位于中部（杂种链），紫外吸收也相应持续两个峰，此也完全符合半保留复制，而彻底排除分散模型。虽然按全保留复制也只产生两条带，但比例和位置都不符合，结合第一步实验也可完全排除。从而十分信服地证实了DNA半保留复制是完全正确的。

然而上述对实验的叙述使不完全的，事实上Meselson和Stahl取样时在1代之前还取了0.3代和0.7代样品，结果显示在上部和中上部之间存在两个峰，其中0.3代的下部峰明显，而0.7代中上部峰明显。但是Meselson和Stahl没有解释这个不明显的事实。事实上，如果Meselson和Stahl连续取样，则会出现上部与中上部之间连续的峰移现象。也就是说，这种结果可能支持分散模型。导致这种连续变化结果的原因是，细菌DNA复制事实上是不连续的，在时间上也不同步，而且，当第一轮复制还没有完成日夏养花网的时候，第二轮就已经开始了。

这种不连续复制后来称为半不连续复制。因为DNA聚合酶只能由5向3方向复制（先导链），这样，在一个复制叉中3向5侧就不能立即复制，而要等到前者复制到一定时间才能开始（后滞链）；于是形成了不连续复制片段。这些片段中的DNA倒不会影响结果，但是因为这样的复制总是要以RNA作为引物，而这些引物常常是在相当时间后的DNA修复中去除并重新补充上DNA，这些修复的DNA片段因为是后合成的，在细菌培养基更换中会导致14N到15N的混杂。这样连续的DNA链就有从14N到15N的结构。

然而实验中并没有出现明显的连续峰移，其中的原因在于一个非常巧合的因素：Meselson和Stahl在实验中使用注射器将DNA注射入CsCl离心管时，注射器会使得DNA片段化，并且使得混合片段减少到1/200，从而在实验中无法清晰显示出来。

各种巧合得出来正确的结论，形成了“生物学中最漂亮的实验”。当然，Meselson和Stahl还进行了第二阶段的实验，附在后面大家自己阅读，同样也有巧合因素在这里。

2.将第一代的14N / 15N杂种链经变性将双链分开，然后再将变性前后的双链和单链分别进行CsCl密度梯度离心。变性前杂种双链只有一种带，密度为1.717克/厘米3，变性后两条单链的密度不同，因而呈现了两条带，一条为15N带，（1.740克/厘米3），另一条为14N带（1.725克/厘米3）。而同时进行作对照的样品是从肺炎球菌（D. pneumoniae）中提取的DNA，变性前后都只有一条带，密度为1.700克/厘米3。这一结果完全符合半保留复制预期的结果，并彻底否定了“分散模型”和与之类似的末端相连保守模型（end-end conservative），这两种模型的第一代子链和半保留模型难以区别，但通过变性其两条单链的结构相同，故预期和肺炎球菌一样只能出现相同的一条离心带，但实验结果却是两条带。

   

DNA是双螺旋结构，所以有两条核苷酸链。在15N标记实验中，有一条链被15N标记的DNA离心后居中（称为中带），两条链都被标记的DNA离心后位于下层（称为重带），没有被标记的DNA位于上层(称为轻带)。
DNA是半保留复制的。当大肠杆菌繁殖一代时，全部的日夏养花网DNA都是一条链被标记；繁殖两代时，有一半DNA两条链被标记，一半DNA一条链被标记。所以答案是一半居中，一半位于下层。你的选项打错了，B和D一样，而且没有正确答案。
如果有不理解的地方日夏养花网，请追问。

科学家以大肠杆菌为实验对象，运用同位素示踪技术及密度梯度离心方法进行了DNA复制方式的探索实验，实验内容及结果见下表．
组别 1组 2组 3组 4组
培养液中唯一氮源 14NH4Cl 15NH4Cl 14NH4Cl 14NH4Cl
繁殖代数 多代 多代 一代 两代
培养产物 A B B的子I代 B的子II代
操作 提取DNA并离心
离心结果 仅为轻带
（14N/14N） 仅为重带
（15N/15N） 仅为中带
（15N/14N）
1
2
轻带（14N/14N）
1
2
中带（15N/14N）
请分析并回答：
（1）要得到DNA中的N全部被放射性标记的大肠杆菌B，必须经过代培养，且培养液中的是唯一氮源．
（2）综合分析本实验的DNA离心结果，第组结果对得到的结论起到了关键作用，但需把它与第组的结果进行比较，才能说明DNA分子的复制方式是 ．
（3）分析讨论：
①若将子I代DNA双链分开后再离心，其结果是 （选填“能”或“不能”）判断DNA的复制方式．
②若某次实验的结果中，子I代DNA的“中带”比以往实验结果的“中带”略宽，可能的原因是新合成的DNA单链中的N尚有少部分为．
③若在同等条件下将子II代继续培养，子n代DNA离心的结果是：密度带的数量和位置是，放射性强度发生变化的是带．
考点：DNA分子的复制
专题：
分析：分析表格：DNA的复制方式可能为半保留复制、全保留复制和混合复制．
若为全保留复制，则3组中子代DNA经离心后应该分为轻带（14N/14N）和重带（15N/15N），而实际只有中带（14N/15N），说明DNA复制不是全保留复制；
若为混合复制，则4组中子代DNA经离心后应该只有中带（14N/15N），而实际结果与之不符，说明DNA复制不是混合复制，则DNA的复制方式为半保留复制．
解答：解：（1）培养液中以15NH4Cl为唯一氮源，需经过多代培养，才能要得到DNA中的N全部被放射性标记的大肠杆菌B．
（2）若证明DNA的复制为半保留复制，则需证明后代DNA的两条链，一条链是母链，另一条链是新合成的子链，第3组结果与第1组、第2组的结果对比可以证实．
（3）①将子Ⅰ代DNA双链分开后再离心，无法判断后代DNA的两条链的来源，不能判断DNA的复制方式．
②“中带”为14N/15NDNA，“中带”略宽，说明新合成的DNA单链中N尚含有部分15N．
③将子Ⅱ代继续培养，子n代DNA的情况是有两个为14N/15NDNA，其余全部为14N/14NDNA，所以子n代DNA离心的结果是：密度带的数量和位置没有变化，放射性强度发生变化的是轻带．
故答案为：
（1）多15NH4Cl
（2）31和2半保留复制
（3）不能15N没有变化轻
点评：本题以大肠杆菌为素材，运用同位素示踪技术及密度梯度离心方法进行了DNA复制方式的探索实验，要求考生认真分析表中实验结果，根据结果推测DNA复制方式，得出正确的实验结论，属于考纲理解和应用层次的考查．

大肠杆菌培养在含15N的培养基中若干代，子代的大肠杆菌的DNA中的N均为15N．把被15N标记的一个大肠杆菌培养在含14N的培养基中，复制n次后，则子代中含有15N标记的大肠杆菌为2个，总共产生子代大肠杆菌为2n个．连续培养三代，在第三代大肠杆菌DNA总量中带有15N标记的DNA占223=25%．
故选：B．

先回答你关于DNA数量的疑问。
这道题可以说是将一个
细胞
内的所有DNA都看做一个整体。确实，一个细胞里存在着成千上万的DNA
分子
，但分裂来的细胞也可以大致看做拥有同样数量的DNA，所以，可以简单地将每个细胞里的DNA看成1个单位。
这道题主要考察的是你对DNA
半保留复制
的理解。
DNA是
双链
结构
，其中
亲代
双链分离后，每条单链均作为新链合成的模板。因此，复制完成时将有两个
子代
DNA分子，每个分子的
核苷酸序列
均与亲代分子相同，这是1953年沃森(J.D.Watson)和克里克(F.H.C.Crick)在
DNA双螺旋结构
基础上提出的
假说
，1958年得到实验证实。
最初用15N
标记
的DNA分子是
母链
，新合成
的子
链都是14N标记的。
第一次分裂，一个细胞分裂成两个。每个细胞含有的是杂合的DNA分子，即一条链是15N，另一条是14N标记的。
第二次分裂，两个细胞分裂成四个。这时就会出现两个细胞中的DNA完全是含14N的
脱氧核糖核酸
组成的。
依次类推，经过4次分裂，总细胞数为2的4次方，即16个。
其中，含有15N的是第一次分裂得到的2个细胞。
2/16=1/8=12.5%

不是，DNA中的N不可能全部标记。在复制时亲代的DNA半保留进入子代还是N，另外制取15N的NH4Cl不可能达100%

可以这么理解，因为繁殖的过程中，是指数式的增长。如果原来是14N的，原本是半保留复制方法，复制了N次后得到的，DNA分子中2的N次方的DNA中只有两个DNA的其中一条链是含有14N的，其他全都是15N的

不是他们都有n14还只有2个

是的
原来的14N在繁殖几代后，在统计学上可以忽略不计。你就当没有来算好了。

是否可以考虑含14N的两个大肠杆菌死亡，DNA裂解，因此只剩下15N。个人意见，仅供参考。