植物细胞组织培养
一．实验目的

植物细胞和组织培养的技术性强，要求无菌操作，通过本实验可初步掌握常规的组织培养技术，加深对无菌操作的了解。

二．实验原理

植物的全能性：植物体的任何一个细胞都具有生长分化成为一个完整植株的能力，称为植物的全能性。

植物组织培养就是利用植物的全能性进行离体无菌植物培养的一门技术。植物组织培养按其原始意义，就是指愈伤组织培养。但发展至今，其范围日益扩大，已包括植物和它的离体器官、组织、细胞和原生质体的离体无菌培养。因此，拥有几种不同水平的培养技术，即整体的、器官的、组织的、细胞的和原生质的培养技术。它们的涵义是：
1．植株培养。指以具备完整植株形态的材料（如幼苗和较大的植株）外植体的无菌培养。

2． 胚胎培养。指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。

3． 器官培养。指以植物的根，茎，叶，花，果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段，茎的茎尖，茎节和切段，叶的叶原基，叶片，叶柄，叶鞘和子叶，花器的花瓣，雄蕊（花药，花丝），胚珠，子房，果实等的离体无菌培养。

4． 组织培养。指以分离出植物各部位的组织（如分生组织，形成层，木质部，韧皮部，表皮，皮层，胚乳组织，薄壁组织，髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的组织培养。

5． 细胞培养。指以单个的游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞，卵细胞）为接种体的离体无菌培养。

6． 原生质体培养。指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养。

本实验选择烟草和豌豆为材料，烟草（Nicotiana）属茄科植物，是重要的工业原料，也是植物组织培养的四大典型实验植物（烟草、矮牵牛、胡萝卜、芸苔）中重要的一种，它的研究的最为广泛，也始终领先于其他的植物材料，目前，66个烟草品种中，再生成植株的有16个种，通过花药培养再生成花粉植株的有12个种，通过原生质体培养再生成植株的有20个种，通过烟草的种内和种间原生质体融合再生成杂种的植物分别为3个和12个种。豌豆（Pisum sativum）属豆科植物，是粮食、饲料和重要的蔬菜作物，也是遗传学家和植物生理学家感兴趣和乐于采用的实验植物，豌豆的根、茎、子叶、下胚轴、上胚轴、花芽等外植体，皆可形成愈伤组织，其中茎尖、幼胚、幼叶等器官可成功的再生成植株。茎尖培养可包括小http://www.rixia.cc至十几微米的茎尖分生组织（生长点）和大至几十毫米的茎尖或更大的芽培养。在实践应用上，常采用生长点的培养使患病植物去病毒，以达到挽救优良品种，提高产量和质量之目的。

三．实验材料

仪器设备

1．酒精灯、100ml三角烧瓶，9厘米培养皿；

2．镊子、剪刀、解剖针；

3．双筒解剖显微镜；

4．光照培养箱或温室；

材料和试剂

1．材料 烟草无菌苗、豌豆幼苗。

2．试剂

（1）MS培养基，植物激素：NAA、6-BA等；

（2）饱和漂白粉液（次氯酸钠）；

（3）70%酒精、100%酒精、酒精棉球；

（4）无菌水

四．实验步骤

1．烟草无菌苗的快速切繁—继代培养：（要求完全无菌操作）
每组一瓶烟草无菌苗，请细心操作，以免污染。
（1） 在实验台上，点着酒精灯，将双手用酒精棉球擦拭消毒，打开生长好无菌烟草苗的三角瓶，三角瓶的瓶口使用前后需在酒精灯外焰上烧过灭菌。
（2） 用灭菌的镊子轻轻捏出1株幼苗，用灭菌的剪刀将无菌苗剪成0.5-1厘米的小段，要求每段至少包含一个生长点，直接剪入盛有MS培养基的三角瓶中，每一个切段必须直接接触培养基，三角瓶口重新烧过灭菌，并重新封好口。
（3） 在光照培养箱中15~25℃，16小时光照条件下培养4周，可长成完整植株，能用于田间移栽。
2．豌豆苗的茎尖培养
⑴ 取发芽6天的豌豆幼苗10株，简取1厘米左右的茎尖，浸入70%的酒精中1分钟，再浸入饱和次氯酸钠溶液中消毒15分钟，（此步以后要求无菌）用无菌水中冲洗5次，在灭菌的滤纸上吸干水分，放入灭菌的培养皿中。
⑵ 在双目解剖镜下，用灭菌的解剖针剥去幼叶露出生长锥，用灭菌的解剖针挑取带着两至三个叶原基的生长锥。
⑶ 将挑好的茎尖移到MS+10.7mol/L萘乙酸(NAA)+4.4mol/L 6-苄基腺嘌呤（6-BA）的培养基上诱导愈伤组织形成，用封口膜将培养皿封好。
[4]在恒温培养箱中，26℃下,培养六周，形成愈伤组织，经继代后，可用于生根培养。

培养步骤
　　第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质—吐温。 　
　第二步是对材www.rixia.cc料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10～30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。 　　
第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1—2种使用见表。第四步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。
无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用注意：
①酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精杀死植物细胞。
②老熟材料，特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些，如种子可以浸泡5分钟。
③升汞的渗透力弱，一般浸泡10分钟左右，对植物材料的杀伤力不大。
④漂白粉容易导致植物材料失绿，所以对于幼嫩材料要慎用。
⑤在消毒液中加入浓度为0.08—0.12%的吐温20或80（一种湿润剂），可以降低植物材料表面的张力，达到更好的消毒效果。
第四步 把消毒过的外植体接到ms培养基上、在光照培养箱中进行培养、若要得到愈伤组织、则无需光照，直接进行暗培养
第五步 愈伤组织的诱导、把形成的愈伤组织转接到生芽生根培养基上、进行再分化
第六步 得试管苗、转种、

第一步，将采来的植物材料除去不用的部分
第二步是对材料的表面浸润灭菌
第三步是用灭菌剂处理

网上有的教的、

你学过吗，没进实验室就不容易学会。

选取根尖细胞或茎尖细胞（这里的细胞无毒），放入MS培养基，加入生长素和细胞分裂素（脱分化和再分化），最后移栽成活得到无毒植株

条件很苛刻…拿生物书上的例子说

准备：操作人员：进入操作间前先洗手，穿白大褂。

超洁工作台：开紫外线杀菌灯杀菌20分钟，同时开无菌风。

外植体：清水洗涤数次，用少量清洗剂清洗。叶脉突出的植物要特别洗净叶脉槽处。

操作：操作人进入接种室，酒精棉球擦拭手掌；外植体移入工作台面，用升汞（0.9%）浸泡，再用酒精快速擦拭；无菌水漂洗数次。点燃酒精灯，用具入酒精瓶浸泡数分钟，取出在酒精灯上灼烧。拿出培养皿；外植体放在培养皿中，用刀子切割，镊子接种于培养瓶中。

最近有好多新手朋友在咨询一些关于植物组织培养的问题。有的朋友反映由于没有相关的知识背景，理解起来感觉有些吃力。因此为了能让圈外人士也能对植物组织培养有所了解。从今天起我将不定期的写一些关于植物组培基础知识的相关文章，希望对大家有所帮助。本文为科普类小文，专业人士可绕过。

什么是植物组织培养？

1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株。
植物组织培养英文名为plant tissue culture，是将植物上的器官、组织或细胞切割下来。在人工配置的营养基质（又称培养基）上进行无菌培养，同时通过控制培养基成分及温度、光照等其它环境因素，使培养物定向地生长、分化至发育形成完整植株的过程。

植物组织为何能培养？

由德国植物学家Haberlandt在1902年提出的植物细胞全能性（totipotency）理论是植物组织培养的理论依据。细胞全能性理论认为植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。

植物组织培养有什么用途？

1、快速繁殖 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。可以对目标植物进行快速大量的繁殖。例如一株葡萄苗理论上一年可以繁殖到几十万株。

2、种苗脱毒 针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。目前马铃薯、甘薯、草莓、香蕉、葡萄等品种主要就是通过植物组织培养的方法进行脱毒苗的繁育。

3、远缘杂交 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。

4、突变育种 采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种日夏养花网。

5、基因工程 基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。

6、生物制品 有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物--紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红豆杉组织培养中获得生长量高达0.49gFW/（gFWd）的细胞系，每升细胞培养物中紫杉醇的产量可达0.25mg。

植物在进行组织培养时，先修剪植株上的茎尖和花药，然后再分剪成大小相同的小株，浸泡在浓度为70%的酒精溶液中tWIvsb10～30秒，再接种到初代培养基中进行培养。等到细胞开始分化，形成愈伤组织的时候，需要进行继代培养，提高生长素浓度，促进根系生长。

植物进行组织培养的过程
植物组织培养的过程

在植物进行组织培养时，首先需要将多余的部分去除，然后用刷子清洗干净植株表面，再将植株分解成大小相同的小株，伤口处可以涂抹上多菌灵溶液，加快愈合的速度，起到杀菌消毒的作用，用干净的纱布包裹储存。

植物组织培养的过程

进行组织培养的容器需要消毒，可以使用高压灭菌或者过滤除菌，去除容器中的病菌，然后对植株也需要进行消毒处理，需要在超净台或者接种箱中进行，避免空气中的细菌感染植株，浸泡在浓度为70%的酒精溶液中10～30秒。

植物组织培养的过程

当到植株表面完全浸润后捞出，接种到初代培养基中，再将放置在培养室或者光照培养箱中培养，促进植株细胞的分化，快速形成顶芽、叶芽，形成的愈伤组织需要及时移置到分化培养基中培养，保证不同器官的形成。

植物组织培养的过程

当植株分化形成芽和球茎时，需要进行切割，增加芽和球茎的数量，提高繁殖的速度，然后进行继代培养，同时还需要通过脱毒苗培养来检测病毒，然后添加生长素，提高细胞分裂素的浓度，促进幼苗的生根和发芽。

根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术——植物的组织培养技术
　　植物组织培养的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过脱分化（也叫去分化）形成愈伤组织——再经过再分化形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。
　　植物组织培养的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。再适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。
　　植物组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科
植物组织的培养方法：
　　1、非试管微组织快繁
　　非试管微组织快繁技术是将外植体（一般要求带一叶一芽）放置在室内外普通沙子培养基上进行培养，利用植物腋芽自然倍增达到快速繁殖的目的。一般植物7～15天可以生长出根系。此技术投资低，操作环节少。
　　2、试管组织培养
　　试管组织培养是将外植体（即离体组织、器官或细胞）放置在试管等器皿中在无菌的条件下进行组织培养获得试管苗。
　　植物组织培养的优点：
　　1、占用空间小，不受地区、季节限制。
　　2、不携带病毒
　　3、培养周期短
　　4、可用组培中的愈伤组织支取特殊的生化制品
　　5、可短时间大量繁殖，用于拯救濒危植物
　　6、可诱导之分化成需要的器官，如根和芽
　　7、解决有些植物产种子少或无的难题，
　　8、不存在变异，可保持原母本的一切遗传特征
　　9、投资少，经济效益高
　　10、繁殖方式多，试用品种多
　　植物组织培养一般分为以下几种：
　　
　　1、胚胎培养
　　指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。
　　2、器官培养
　　指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段，茎的茎尖、茎节和切段，叶的叶原基、叶片、叶柄、叶鞘和子叶，花器的花瓣、雄蕊（花药、花丝）、胚珠、子房、果实等的离体无菌培养。
　　3、组织培养
　　指以分离出植物各部位的组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的植物组织培养。
　　4、细胞培养
　　指以单个游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞，卵细胞）为接种体的离体无菌培养。
　　5、原生质体培养。
　　指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养。
　　培养材料的采集
　　要根据培养目的适当选取材料，选择原则：易于诱导、带菌少。要选取植物组织内部无菌的材料。这一方面要从健壮的植株上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织，有自身消毒作用，这种组织一般是无菌的。培养材料的消毒
　　从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带人培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格www.rixia.cc的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上。
　　试剂
　　�6�1 乙醇。
　　�6�1 吲哚乙酸（ IAA） 或 2 ，4 – D （生长素类似物）。
　　�6�1 氯化汞（升汞）或次氯酸钠。
　　�6�1 6- 苄基氨基腺嘌呤（ 6-BA ）
　　�6�1 MS 培养基
　　�6�1 0.1 mol/L NaOH与 0.1 mol/L HCl
　　配制培养基
　　（ 1 ）愈伤组织诱导培养基： MS 培养基（蔗糖含量为 10 g/L ， 2,4 – D 含量为 2 mg/L ，琼脂 10 g/L ）。
　　（ 2 ）试验培养基：在 MS 培养基中加入 IAA 和 6–BA 。
　　吲哚乙酸（IAA)先用少量 0.1 mol/L NaOH 溶解， 6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量 0.1 mol/L HCl 溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。
　　仪器设备
　　培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（ 100mL ），烧杯，量筒，培养皿，棉线，接种箱或超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，容量瓶，移液管，牛皮纸。
　　培养基灭菌
　　将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至 pH 5.8 ，趁热分装于 100 mL 三角烧瓶中，每瓶约 20 mL 。待培养基冷却凝固后，用一层称量纸和一层牛皮纸包扎瓶（管）口，并用棉线扎牢，然后在高压灭菌锅中 121 ℃（ 1 kg/cm 2 ）下灭菌 20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。
　　植物组织培养步骤
　　第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质—吐温。
　　第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10～30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。
　　第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1—2种使用见表。第四步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用注意：①酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精杀死植物细胞。②老熟材料，特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些，如种子可以浸泡5分钟。③升汞的渗透力弱，一般浸泡10分钟左右，对植物材料的杀伤力不大。④漂白粉容易导致植物材料失绿，所以对于幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入浓度为0.08—0.12%的吐温20或80（一种湿润剂），可以降低植物材料表面的张力，达到更好的消毒效果。
　　植物组织培养的特点
　　1、培养条件可以人为控制
　　组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。
　　2、生长周期短，繁殖率高
　　植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20-30天为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。
　　3、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制
　　植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。
希望对你有所帮助！